Рубрики Привет Geektimes! (пост на сайте Geektimes.ru) Я не знаю удивлю ли тебя я или нет, но сегодня мы будем выделять ДНК. В сети много информации о том, как в домашних условия выделить нуклеиновые кислоты из клеток человека и не только человека. Большинство из этих гайдов похожи на рецепт пирога, описывающих последовательность добавления ингредиентов в тесто. В этой публикации я хочу показать не просто рецепт, а попытаться объяснить что и зачем нужно в этом пироге. В конце концов механизмы получения нуклеиновых кислот что в лаборатории, что дома одни и те же.
Итак, начнем с ингредиентов:
- 100 мл воды, я рекомендую использовать дистиллированную или в крайнем случае кипяченую;
- 5 г Натрия двууглекислого или по-простому питьевая сода (четверть чайной ложки);
- 1,5 г натрия хлорида (соль поваренная, на кончике ножа);
- Любое моющее средство для посуды 5 мл;
- Таблетка с пищеварительными ферментами (панкреатин, фестал, мезим);
- Spiritus vini rectificati solutio 96% (спирт этиловый 96%);
Клетки собственного тела, можно и не собственного, можно растительные. Я использовал слюну и клетки слизистой рта, можно использовать другие выделения организма, но не мочу (в ней очень мало клеток) и не фекалии (в этом случае Вы скорее выделите ДНК кишечной палочки чем свою). Как известно, в организме есть еще слизистые и кое-какие жидкости содержащие большое количество клеток, причем с гаплоидным набором хромосом.
Также нам пригодится: пробирки (дома у меня их нет, я использовал стаканчики для анализов они мерные очень удобно), термометр, контейнер или банка с водой, пипетка. В идеале, индикаторная бумага, но можно обойтись без нее.
Приготовление буферного раствора.
Растворим в 100–120 мл воды соль, соду и моющее средство. Как я уже говорил неплохо бы иметь индикаторную бумагу (фенолфталеин, тимоловый синий). Капаем на нее нашим буфером и смотрим pH, он должен быть 8,5 (чуть-чуть розовый фенолфталеин и зеленый тимоловый синий), если что-то не так доводим pH до 8,5. Можно вместо воды использовать физиологический раствор, тогда соль не нужна.
Зачем нужен буфер?
Буфер нужен чтобы разрушить клеточную мембрану, ядерную мембрану, митохондрии и другие мембранные компартменты. Нормальный pH клетки порядка 7,2–7,5, а мы помещаем клетки в раствор с pH 8,5. То есть концентрация H+ ионов внутри клетки сильно отличается от концентрации ионов в буфере. Таким образом из-за градиента концентраций ионов вода начинает диффундировать из клетки. Основную роль в разрушении мембран играет лаурилсульфат натрия, содержащийся в средстве для мытья посуды. Это амфифильное вещество способное взаимодействовать как с гидрофильными, так и с гидрофобными. Клеточные мембраны представляют собой бислой фосфолипидов, один конец которых гидрофобный другой гидрофильный, как раз под действием лаурилсульфата бислой разрушается.
Приготовление раствора протеазы.
Прежде всего нужно измельчить таблетку, я это делал стеклянной бутылкой, затем растворить полученный порошок в небольшом количестве воды.
Откуда взялась протеаза и зачем она нужна?
Действующие вещества фестала:
- Протеазы – группа ферментов, расщепляющих белки (гидролизующих).
- Липазы – группа ферментов, расщепляющих липиды(жиры).
- Амелазы – группа ферментов, расщепляющих крахмал.
В норме в клетке присутствуют гидролазы в лизосомах, активирующиеся при повреждении мембраны, которое происходит в буферном растворе. Однако, для ускорения процесса и окончательного развала клетки следует использовать сторонние ферменты.
Мы приготовили необходимые растворы, теперь тщательно прополощем рот чистой водой, покусывая щеки, и сплюнем в чистую пробирку. Так мы получили клетки. Зальем наши клетки 5–10 мл буферного раствора для того, чтобы разрушить мембраны, при этом будем аккуратно перемешивать содержимое пробирки в течении 1–2х минут. После этого этапа, нальем теплую воду в контейнер или банку (температура воды должна быть 36–38 по Цельсию, при такой температуре активируется фермент). После этого добавим в смесь буфера и клеток раствор протеазы и инкубируем в импровизированном термостате 10 минут.
Прошло 10 минут, и наступил самый ответственный момент, добавление спирта. Достаем из морозилки колбу, флакон со спиртом. Открываем пробирку с нашей смесью, наклоняем ее под 45 градусов и очень осторожно наливаем в нее спирт в соотношении 1: 1, не перемешивая фракции. Оставляем на пару минут, пока нуклеиновые кислоты не выделятся в спирт в виде еле заметных нитей.
Почему спирт? Зачем охлажденный?
Спирт отнимает воду, и в нём ДНК не растворима и выделяется в виде нитей. Холод, вообще говоря, не обязателен осаждение происходит и при комнатное температуре, однако он ускоряет процесс осаждения. Не стоит забывать, что в нашем растворе много агрессивных веществ которые могут повредить образец.
За основу я взял метод описанный в довольно странном научно-популярном журнале “Кот Шрёдингера”. Автор оригинальной статьи Анна Лопатина.
ДНК выделили осталось поставить ПЦР и электрофорез на коленке!